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      【通蔚生物】:ELISA試劑流式細胞術知識分享

      流式細胞術中會使用多種熒光試劑,包括熒光偶聯抗體、DNA結合染料、活性染料、離子指示劑染料和熒光蛋白。在過去的幾年里,由于相關試劑種類和數量的增加,用于流式細胞術實驗的參數數量發生了爆炸性增長。比如,用于偶聯單克隆抗體的熒光染料,如串聯染料和聚合物染料的數量急劇增加。此外,除了GFP之外,可用于轉染的熒光蛋白也有所增加,如mCherry、mBanana、mOrange、mNeptune等。本文就為大家介紹一下常用的流式熒光試劑。


      有機小分子

      有機小分子如熒光素(MW=389 D)、Alexa Fluor 488(熒光素類似物)、Texas Red (325 D)、Alexa Fluor 647 (1464 D)、Pacific Blue和Cy5 (762 D)通常用于抗體偶聯。它們具有一致的發射光譜,但有一個小的Stokes位移(激發波長和發射波長之間的差,約50-100 nm)。有機小分子很穩定,且很容易與抗體結合。目前,一些染料(例如Alexa Fluor, Thermo Fisher)經過特殊設計,可減小成像時的光漂白效應,是樣品需要成像分析時更好的試劑選擇。


      藻膽蛋白

      藻膽蛋白是來源于藍藻、鞭毛藻等藻類的大型蛋白質分子。藻膽蛋白的分子量大(例如藻紅素(PE)的分子量為240kD),非常適合于定量流式細胞術,因為它們在偶聯過程中通常有1:1的蛋白質與熒光色素比例。藻膽蛋白具有較大的Stokes位移(75-200 nm)和穩定的發射光譜。然而,藻膽蛋白易受光漂白效應影響,不建議長時間或反復暴露于激發光源。常用的藻膽蛋白有藻紅蛋白(PE),藻藍蛋白(APC)和葉綠素蛋白(PerCP)等。
      藻紅素及其輔因子結構示意圖


      量子點

      量子點 (Qdots) 是半導體納米晶體,具有與納米晶體尺寸相關的緊密熒光發射光譜。它們最適合用紫外或紫色激光激發,但也可能被多個激光最低限度地激發。當 Qdots 用于多參數實驗時,這種最小激發使熒光補償復雜化。由于補償問題和難以結合抗體,Qdots在多參數染色面板中已在很大程度上被聚合物染料取代。


      高分子聚合物染料

      聚合物染料由收集光信號的聚合物鏈組成,可以根據聚合物鏈的長度和連接的分子亞基,吸收和發射特定波長的光。聚合物染料非常穩定,具有與藻膽蛋白相似的量子效率,且光穩定性大大提高。由于聚合物染料只能吸收特定波長的光,因此避免了量子點試劑在多參數實驗中難以進行多次激光激發的問題。常見的聚合物染料有亮紫(BV)、亮紫外(BUV)和亮藍(BB)試劑。


      串聯染料

      串聯染料由藻膽蛋白(PE、APC、PerCP)或聚合物染料(BV421、BUV395)與小的有機熒光染料(Cy3、Cy5、Cy7)化學偶聯而成,可用單個激光源進行激發,這種染料增加了可由單個激光激發的熒光染料的種類。例如,Texas Red的最大激發波長為589 nm,PE的發射波長為585 nm,因此通過將PE偶聯到Texas Red, PE的發射光通過熒光能量轉移(FRET)激發Texas Red,使PE-TxRed串聯染料可以被488 nm或532 nm激光激發。聚合物鏈抗體使用相同的方法來增加可由單個激光激發的熒光染料。串聯染料非常明亮,具有較大的Stokes位移值 (150-300 nm),這在處理低抗原密度樣本時非常有用。然而,串聯染料的穩定性不如供體熒光染料,而且它們的能量轉移效率因批次而異,使補償變得復雜。大多數較長的Brilliant聚合物染料也是串聯的,也存在上述問題。
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