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ELISA試劑盒背景值高?別怕!新手也能輕松搞定

發(fā)布時(shí)間:2024-04-18     發(fā)布作者:通蔚生物

  在科研實(shí)驗中,在進(jìn)行ELISA試劑盒實(shí)驗過(guò)程,通常會(huì )遇到一些常見(jiàn)問(wèn)題——ELISA高背景問(wèn)題。高背景信號會(huì )降低 ELISA 的靈敏度和特異性,并影響結果的準確性。它可能導致假陽(yáng)性結果,或掩蓋低濃度待測物的信號。因此,減少ELISA背景噪音有助于提高實(shí)驗的準確性,為了實(shí)驗準確性,下面通蔚生物為大家盤(pán)點(diǎn)一些影響因素,對于噪音困擾,你可以對照這些因素來(lái)試著(zhù)解決。如果還未解決,也可以尋求我們在線(xiàn)技術(shù)顧問(wèn)。

elisa背景值

  因素一、洗滌不充分


  在ELISA實(shí)驗步驟中要涉及到洗滌,如果不充分的洗滌,會(huì )未結合的物質(zhì)(例如非特異性結合的抗體或檢測試劑)殘留在微孔板孔中,它會(huì )增加背景噪音。如有必要,可以通過(guò)增加洗滌緩沖液中的鹽濃度來(lái)阻止非特異性結合相互作用。如果背景太高并且您懷疑洗滌步驟不充分,在適當的情況下向洗滌緩沖液中添加洗滌劑或蛋白質(zhì),或者在兩次洗滌之間浸泡幾分鐘。


  因素二、封閉問(wèn)題


  在ELISA實(shí)驗步驟中涉及到封閉,封閉不充分可產(chǎn)生信號的抗體非特異結合的機會(huì )。這時(shí),我們會(huì )用封閉緩沖液,封閉緩沖液的作用是用非特異性結合的不相關(guān)蛋白質(zhì)(或多種蛋白質(zhì))浸泡板或微孔中的潛在結合位點(diǎn)(基本上是任何剩余的粘性點(diǎn))。這隨后減少了信號產(chǎn)生抗體非特異性結合的機會(huì )。


  在實(shí)驗之后,你可能會(huì )發(fā)現背景較高,如果您懷疑是封閉不足,您可以嘗試使用更高濃度的封閉劑,或增加封閉時(shí)間。希望阻斷劑不會(huì )掩蓋抗體抗原上的結合位點(diǎn)。


  市面上的封閉劑分2種類(lèi)型:蛋白質(zhì)和非離子去垢劑。具體使用哪種類(lèi)型取決于許多因素,包括板的表面化學(xué)、吸附在其上的抗原、抗體和檢測試劑。


  最常見(jiàn)的非離子洗滌劑阻滯劑是Tween-20。去垢劑阻滯劑價(jià)格便宜、穩定,并且可用于去除洗滌步驟中的一些非特異性結合。它的缺勢是它們很容易被洗掉。因此,所有洗滌溶液中也必須添加洗滌劑阻滯劑。注意不要使用高濃度(正常濃度約為0.01-0.1%),這會(huì )減少特異性結合并產(chǎn)生假陰性。另一種選擇是同時(shí)使用蛋白質(zhì)和非離子洗滌劑阻滯劑,后者可以在洗滌步驟中幫助阻滯。


  與洗滌劑不同,蛋白質(zhì)阻滯劑是永久性的。它們與開(kāi)放空間結合并封閉它們,并且還穩定與微孔板結合的抗原分子。洗掉多余的封閉緩沖液后,蛋白質(zhì)封閉劑仍然存在(與去污劑封閉劑不同)。常見(jiàn)的蛋白質(zhì)阻滯劑包括牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉、普通全血清和魚(yú)明膠。對于主要的阻斷問(wèn)題,使用全血清作為阻斷劑可能很有吸引力,因為血清成分固有的多樣性使其能夠有效阻斷許多不同類(lèi)型的分子相互作用。然而,全血清的缺點(diǎn)是它會(huì )與檢測反應中常用的ProteinA和抗IgG抗體發(fā)生交叉反應。解決這個(gè)缺點(diǎn)的一個(gè)方法是使用來(lái)自雞或魚(yú)的完整正常血清。


  其實(shí)封閉是ELISA實(shí)驗比較關(guān)鍵的一個(gè)步驟,大家在做實(shí)驗時(shí),可以查看你具體使用的封閉試劑,在實(shí)驗過(guò)程持續優(yōu)化。


  問(wèn)題三、抗體濃度過(guò)高或低


  抗體濃度過(guò)高會(huì )增加非特異性結合,抗體濃度過(guò)低會(huì )降低檢測靈敏度。大家在進(jìn)行ELISA實(shí)驗之前,可以參考劑盒說(shuō)明書(shū),商業(yè) ELISA 試劑盒通常會(huì )提供建議的抗體濃度范圍,可以作為參考。


  問(wèn)題四、檢測試劑不合理


  在ELISA實(shí)驗過(guò)程,檢測試劑使用合理非常重要!使用濃度過(guò)高或稀釋不當,可能會(huì )導致背景較高。不要使用檢測試劑過(guò)度顯色-如有必要,優(yōu)化何時(shí)使用終止液。


  上述是ELISA實(shí)驗中背景過(guò)高因素及問(wèn)題優(yōu)化辦法,其實(shí)背景問(wèn)題不要過(guò)于擔心,在實(shí)驗過(guò)程多總結多嘗試這些問(wèn)題后續也會(huì )消失!如果在使用ELISA試劑盒遇到問(wèn)題,也可以和我們在線(xiàn)顧問(wèn)尋求幫助!