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PCR、RT-PCR 和 qPCR:哪種技術(shù)是你的科研助手?

發(fā)布時(shí)間:2024-04-26     發(fā)布作者:上海通蔚生物

  聚合酶鏈式反應(PCR)是一種相對簡(jiǎn)單且廣泛使用的分子生物學(xué)技術(shù),用于擴增和檢測DNARNA序列。與傳統的DNA克隆和擴增方法相比,PCR只需要數小時(shí),具有快速、高效和特異性強。因為實(shí)驗需求,目前在PCR基礎上改進(jìn)。大家在實(shí)驗中還接觸到了RT-PCRqPCR。今天,上海通蔚給大家來(lái)介紹一下它們之間的區別。


  PCR


  聚合酶鏈反應,也就是PCRpolymerasechainreaction)技術(shù),這是一種使用DNA聚合酶拷貝選定DNA區域的技術(shù),由KaryMullis及同事在20世紀80年代發(fā)明,KaryMullis也因此被授予了諾貝爾化學(xué)獎。PCR常用于基因克隆、基因分析、基因診斷、DNA指紋識別等領(lǐng)域。


  PCR實(shí)驗前需要 DNA聚合酶、鎂、核苷酸、引物、待擴增的DNA模板和熱循環(huán)儀。PCR由三個(gè)步驟組成:變性-退火-延伸。


  模版DNA變性:雙鏈DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后,使其解離使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備;


  模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結;


  引物的延伸:DNA模板-引物結合物在72℃、DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶)的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基互補配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。經(jīng)過(guò)一系列溫度和時(shí)間的變性、退火和延伸過(guò)程稱(chēng)為一個(gè)擴增循環(huán)。循環(huán)的每個(gè)步驟都應針對所使用的模板和引物組進(jìn)行優(yōu)化。該循環(huán)重復大約20-40次,然后通常通過(guò)瓊脂糖凝膠分析擴增產(chǎn)物。



圖1 PCR擴增示意圖


  RT-PCR


  逆轉錄PCRreversetranscription PCR)或者稱(chēng)反轉錄PCRreversetranscription-PCR,RT-PCR),是聚合酶鏈式反應(PCR)的一種廣泛應用的變形。RT-PCR靈敏度高,操作簡(jiǎn)單,常用于基因表達分析、病毒檢測、RNA 病毒的定量等領(lǐng)域等。


  RT-PCRPCR區別在于它是從mRNA模版開(kāi)始,在逆轉錄酶的催化下,隨機引物、oligo(dT)或基因特異性引物的引導下合成互補的DNA(complementaryDNA,cDNA),按照普通PCR的方法用兩條引物以cDNA為模板,則可擴增出不含內含子的可編碼完整基因的序列。


圖2 逆轉錄RT-PCR原理圖


  qPCR


  qPCR實(shí)時(shí)定量PCRreal-timePCR)是是一種在DNA擴增時(shí)(即實(shí)時(shí))對其定量的方法,常用于基因表達定量、病原體檢測、基因分型。與普通PCR一樣,DNA通過(guò)三個(gè)重復步驟進(jìn)行擴增:變性、退火和延伸。在qPCR中,熒光標記可以隨著(zhù)PCR的進(jìn)展收集數據。由于可用的方法和化學(xué)物質(zhì)范圍廣泛,該技術(shù)具有許多優(yōu)點(diǎn)。在基于染料的qPCR(通常為綠色)中,熒光標記允許通過(guò)使用dsDNA結合染料對擴增的DNA分子進(jìn)行定量。在每個(gè)循環(huán)期間,測量熒光。熒光信號隨復制DNA的數量成比例增加。


圖3 qPCR實(shí)時(shí)定量原理圖


  上述為大家介紹了PCR、RT-PCRqPCR區別,選擇哪種技術(shù)取決于實(shí)驗目的和需求。 如果只需要確定是否存在特定 DNA RNA 序列,可以選擇 PCR RT-PCR;如果需要精確量化起始模板的含量,則 qPCR 是更好的選擇。關(guān)于PCR還有疑問(wèn),歡迎前來(lái)咨詢(xún)。上海通蔚有上述三種技術(shù)的PCR試劑盒,對PCR試劑盒有需要的歡迎前來(lái)咨詢(xún),我們PCR試劑盒快速、高效、特異性強。