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一文讀懂酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(ELISA)原理及步驟

發(fā)布時(shí)間:2024-05-07     發(fā)布作者:上海通蔚生物

  酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(ELISA)是一種廣泛應用于生命科學(xué)研究和臨床診斷的免疫分析技術(shù)。該技術(shù)利用抗原抗體特異性結合的原理,通過(guò)酶促反應將待測物質(zhì)的存在與可檢測的信號(例如顏色變化)聯(lián)系起來(lái),從而實(shí)現對目標分子的定性和定量分析。ELISA具有高靈敏度、高特異性、操作簡(jiǎn)便、成本效益高等優(yōu)點(diǎn),使其成為研究人員和臨床醫生常用的工具。

elisa試劑盒

ELISA試劑盒


  ELISA可以用于檢測多種類(lèi)型的生物分子,包括蛋白質(zhì)、肽、激素、抗體、細胞因子等。其應用范圍涵蓋免疫學(xué)、細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、臨床醫學(xué)、食品安全、環(huán)境監測等多個(gè)領(lǐng)域。例如,ELISA可以用于:



  •   檢測疾病標志物:輔助疾病的診斷、預后評估和治療監測



  •   研究蛋白質(zhì)表達和功能:分析細胞信號通路和蛋白質(zhì)相互作用



  •   藥物開(kāi)發(fā)和篩選:評估藥物的療效和安全性



  •   食品安全檢測:檢測食品中的污染物和毒素



  •   環(huán)境監測:檢測環(huán)境樣品中的污染物



  本文將詳細介紹ELISA技術(shù)的原理、類(lèi)型步驟、應用和注意事項,幫助讀者全面了解和掌握這項重要的實(shí)驗技術(shù)。


  ELISA技術(shù)原理


  酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(ELISA)是一種基于抗原抗體特異性結合的檢測技術(shù),將已知抗原和抗體結合在固相載體(酶標板)表面,并保持其免疫活性。測定時(shí),將待檢樣本加入固相載體,使其與表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應。隨后,加入酶標記的抗原或抗體,進(jìn)一步形成復合物。 通過(guò)洗滌去除未結合的物質(zhì)后,加入酶底物進(jìn)行顯色反應。 根據顯色結果,可以定性或定量分析目標分子的存在和含量。


elisa原理

圖1  ELISA原理


  ELISA實(shí)驗中常見(jiàn)的試劑



  •   固相抗原和抗體。固相抗原和抗體是ELISA實(shí)驗關(guān)鍵試劑,抗原和抗體在酶標板特異性結合反應解決生物學(xué)科研難題。



  •   酶標記抗體。酶標記抗體是鏈接特異性抗原識別和信號放大橋梁。它能夠識別并結合樣品中目標抗原上的特定抗原表位,并偶聯(lián)一種酶(例如辣根過(guò)氧化物酶 HRP 或堿性磷酸酶 AP),加入底物,酶會(huì )催化底物發(fā)生反應,產(chǎn)生可檢測的信號。



  •   底物。底物是實(shí)驗最后階段,它和沒(méi)標記抗體反應時(shí),實(shí)驗的結果將在酶標板上顯出色彩和熒光劑。



  ELISA常見(jiàn)的類(lèi)型及步驟


  直接法ELISA


  將抗原按一定的比例稀釋好包被到固相載體上,然后加入稀釋好的特異性的酶標抗體,孵育后加入底物顯色并判讀結果。

直接ELISA

圖2 直接ELISA法


  直接ELISA法步驟:



  •   將已知的抗原按一定比例稀釋后,包被到酶標板或其他固相載體表面,形成一層抗原涂層。



  •   加入針對該抗原的特異性酶標抗體,使其與固相載體上的抗原結合。在適宜的溫度和時(shí)間下孵育,使抗原抗體充分結合。去除未結合的酶標抗體。



  •   加入酶的底物,底物被酶催化后發(fā)生顯色反應,產(chǎn)生可檢測的顏色變化。 根據顯色結果,可以定性或定量分析樣品中目標抗原的存在和含量。



  直接法ELISA的優(yōu)點(diǎn)是



  •   操作步驟簡(jiǎn)單,耗時(shí)短。



  •   不需要使用二抗,避免了二抗可能帶來(lái)的交叉反應。



  直接法ELISA的缺點(diǎn)是



  •   靈敏度較低,不適用于檢測低豐度抗原。



  •   每種靶抗原都需要制備相應的酶標抗體,成本較高。



間接法ELISA


  將已知抗原連接在固相載體上,待測抗體與抗原結合后再與酶標二抗結合,形成抗原一待測抗體-酶標二抗的復合物,復合物的形成量與待測抗體量成正比,屬非競爭性反應類(lèi)型。

間接ELISA

圖3 間接法ELISA

間接法ELISA步驟:

  

  • 將已知抗原固定在固相載體上:類(lèi)似于直接法ELISA,首先將已知的抗原包被到酶標板或其他固相載體表面。



  •   加入待測抗體:加入待測樣本(例如血清),如果樣品中含有針對該抗原的特異性抗體,則會(huì )與固相載體上的抗原結合。



  •   加入酶標二抗:加入帶有酶標記的二抗,二抗可以識別并結合待測抗體的Fc段。



  •   孵育、洗滌、顯色、判讀結果:與直接法ELISA類(lèi)似,經(jīng)過(guò)孵育、洗滌、顯色等步驟后,根據顯色結果可以判斷樣品中是否存在針對該抗原的特異性抗體,并進(jìn)行定量分析。



  間接法ELISA的優(yōu)點(diǎn)是



  •   靈活性高,可以使用一種酶標二抗檢測多種不同的抗體,只需更換固相抗原即可。



  •   靈敏度較高,因為二抗可以放大信號。



  間接法ELISA的缺點(diǎn)是:



  •   操作步驟比直接法ELISA復雜,耗時(shí)較長(cháng)。



  •   可能會(huì )發(fā)生非特異性結合和交叉反應,影響檢測結果的準確性。



  夾心法ELISA


  夾心法ELISA分為直接夾心法和間接夾心法,檢測抗體是酶標抗體,則可稱(chēng)為直接夾心ELISA;檢測抗體不帶有標記,則還需要使用酶標二抗與檢測抗體結合,這種稱(chēng)為間接夾心ELISA。

夾心ELISA

圖4 夾心法ELISA


  夾心法 ELISA 步驟



  •   包被捕獲抗體:將捕獲抗體固定在ELISA板上。



  •   加入待測樣品:加入待測樣品,如果樣品中含有目標抗原,則會(huì )被捕獲抗體捕獲。



  •   加入檢測抗體:加入檢測抗體,檢測抗體可以識別并結合目標抗原上的另一個(gè)表位。



  •   后續步驟:根據檢測抗體是否帶有酶標記,進(jìn)行直接或間接ELISA的后續步驟(孵育、洗滌、顯色、判讀結果)。



  夾心法ELISA優(yōu)點(diǎn):



  •   高靈敏度:由于使用了兩種抗體來(lái)識別抗原,夾心法ELISA具有很高的靈敏度,可以檢測到低豐度的抗原。



  •   高特異性:兩種抗體識別抗原上不同的表位,大大降低了非特異性結合和交叉反應的可能性,提高了檢測的特異性。



  •   適用范圍廣:可以用于檢測多種類(lèi)型的抗原,包括蛋白質(zhì)、多肽、激素等。



  •   操作相對簡(jiǎn)單:與競爭法ELISA相比,夾心法ELISA的操作步驟相對簡(jiǎn)單。



  夾心法ELISA缺點(diǎn):



  •   需要配對抗體:進(jìn)行夾心法ELISA需要兩種針對不同表位的抗體,配對抗體的選擇和驗證比較關(guān)鍵,也增加了實(shí)驗成本。



  •   不適用于小分子抗原:夾心法ELISA需要抗原具有至少兩個(gè)抗體結合位點(diǎn),因此不適用于檢測小分子抗原。



  •   可能存在鉤狀效應:當抗原濃度過(guò)高時(shí),可能會(huì )出現鉤狀效應,導致檢測信號降低,影響結果的準確性。



  競爭法ELISA


  首先將特異性抗體吸附于固相載體表面,經(jīng)洗滌后分成兩組:一組加酶標記抗原和被測抗原的混合液;而另一組只加酶標記抗原,再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色,這兩組底物降解量之差,即為所要測定的未知抗原的量。這種方法所測定的抗原只要有一個(gè)結合部位即可。



  •   包被捕獲抗體:將特異性抗體(捕獲抗體)固定在固相載體表面。



  •   分組:將酶標板分成兩組,一組加入待測樣品和酶標抗原的混合物,另一組只加入酶標抗原。



  •   競爭結合:待測樣品中的抗原和酶標抗原會(huì )競爭結合固相載體上的捕獲抗體。



  •   孵育、洗滌、顯色:經(jīng)過(guò)孵育、洗滌、顯色等步驟后,兩組都會(huì )產(chǎn)生顏色反應。



  •   結果分析:待測樣品中抗原濃度越高,與酶標抗原競爭結合捕獲抗體的能力越強,導致結合到固相載體上的酶標抗原越少,最終顯色信號越弱。通過(guò)比較兩組的顯色信號差異,可以間接反映待測樣品中抗原的濃度。



  競爭法ELISA的優(yōu)點(diǎn)是:



  •   可以檢測小分子抗原:適用于檢測只有一個(gè)表位的抗原,例如激素、藥物等。



  •   對樣品純度要求低:樣品中的雜質(zhì)對檢測結果的影響較小。



  競爭法ELISA的缺點(diǎn)是:



  •   靈敏度較低:與夾心法ELISA相比,競爭法ELISA的靈敏度較低。



  •   操作步驟相對復雜:需要設置對照組,并進(jìn)行信號差異的比較。



  ELISA樣本及應用


  ELISA可檢測和計數體液樣本中的某些抗體、抗原、蛋白質(zhì)和激素。這包括血液、血漿、尿液、唾液(唾液)和腦脊液(CSF)。


  ELISA是免疫測定的黃金標準。使用ELISA的測試可以幫助診斷多種疾病,從細菌和病毒感染(如萊姆病和HIV)到內分泌疾?。ㄈ缂谞钕偌膊。?。


  家庭妊娠測試甚至基于ELISA技術(shù)。他們檢測到一種叫做人絨毛膜促性腺激素(HCG)的激素——“懷孕激素。


  ELISA廣泛用于食品行業(yè),用于檢測法律要求的成分標簽中是否存在過(guò)敏原。該應用極大地受益于ELISA的靈敏度,并且可以檢測濃度低至百萬(wàn)分之幾(ppm)的潛在食品過(guò)敏原污染物的水平。它還具有能夠檢測油和其他物質(zhì)(如蛋清或牛奶)的優(yōu)點(diǎn),而PCR等無(wú)法檢測到這些物質(zhì)。


  使用ELISA試劑盒時(shí)的注意事項


  該試劑盒僅適用于研究目的,不適用于診斷或治療用途。


  ELISA試劑盒過(guò)期后必須停止使用。


  盡量不要將不同批次的試劑混入試劑盒中。


  該試劑盒的制作和測試用于檢測特定樣品以及手冊中存在的目標。最終用戶(hù)必須非常小心地將其進(jìn)一步用于任何其他目的。


  ELISA試劑盒的安全說(shuō)明


  ELISA試劑盒提供的終止液通常是酸性溶液。確保正確安全地使用試劑,以避免任何風(fēng)險。


  您必須處理并丟棄所有生物材料,因為它們是潛在有害的材料。因此,請務(wù)必遵守當地的規則和法規。


  手套、實(shí)驗服、護目鏡和外科口罩等個(gè)人安全設備是這些實(shí)驗的必需品。吸入任何這些物質(zhì)都會(huì )產(chǎn)生副作用。


  使任何ELISA檢測成功的技巧


  任何ELISA檢測都不可能在一夜之間取得成功。最終的努力可以實(shí)現這一目標。下面給出了一些成功ELISA檢測的有用技巧。


  一致性是關(guān)鍵


  雖然一致性似乎是一個(gè)顯而易見(jiàn)的目標,但有一些假設可能會(huì )影響其在板之間的存在。應該避免混合ELISA試劑盒中的不同成分,因為它們可能會(huì )導致潛在的損害。


  確保測定的準確性


  您可以通過(guò)確保檢測中的每個(gè)點(diǎn)都有重復項來(lái)努力提高其準確性。這可能包括從背景到樣品孔的任何內容。最重要的是,它可以讓您立即識別任何異常值。


  防止污染


  ELISA測定成功的關(guān)鍵是樣品的變異系數較低。確保它們都沒(méi)有超過(guò)理想的百分比,因為它可能導致進(jìn)一步的污染。


  好了,上述為大家介紹了酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(ELISA)原理和步驟。在ELISA實(shí)驗中大家嚴格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗,上文為大家介紹基本原理和步驟,也希望大家在實(shí)驗過(guò)程善于總結。也祝大家實(shí)驗順利。