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ELISA實(shí)驗原理及步驟:從入門(mén)到精通

發(fā)布時(shí)間:2024-06-25     發(fā)布作者:上海通蔚生物

  ELISA是酶聯(lián)免疫吸附分析的縮寫(xiě)。在這種實(shí)驗方法中,使用免疫吸附劑(與固體表面結合的抗原或抗體)和酶聯(lián)免疫反應物。例如,ELISA用于利用未標記的未知物和標記的反應物之間的競爭性結合來(lái)檢測未知濃度。ELISA不但成為了一種非常簡(jiǎn)便的研究工具,而且迅速地應用于各種生物活性物質(zhì)及標志物的臨床檢測,并在臨床應用中逐步取代了放免技術(shù)。下面上海通蔚為大家全面了解ELISA實(shí)驗原理、步驟和注意事項.

  ELISA試劑盒原理


  ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定) 是一種將抗原、抗體的免疫反應和酶的高效催化反應有機結合而發(fā)展起來(lái)的一種綜合性技術(shù)。其基本原理是利用抗原抗體反應的特異性,將待測物質(zhì)與酶標記的抗體或抗原結合,通過(guò)酶催化底物顯色反應,根據顏色深淺進(jìn)行定性或定量分析。根據抗原抗體反應的結合方式,有直接法、間接法、夾心法、競爭法等。下面詳細介紹:

  直接ELISA


  在直接ELISA中,待測抗原被吸附到反應板的孔中,并進(jìn)行洗滌去除未結合的抗原。隨后,添加酶標記的抗體,該抗體能夠特異性識別抗原??贵w與抗原結合后,加入底物溶液,酶催化底物發(fā)生顏色變化,顏色變化的程度與樣本中抗原的含量成正比。

  

  優(yōu)缺點(diǎn)分析:

  1.優(yōu)點(diǎn):
  • 操作簡(jiǎn)單快速:直接ELISA僅使用一種抗體,步驟較少,減少了誤差的可能性,提高了實(shí)驗效率。
  • 避免交叉反應:直接ELISA不使用第二抗體,因此可以避免第二抗體與其他抗體的交叉反應,提高檢測的特異性。


  2.缺點(diǎn):
  • 抗體標記難度:為每種抗原準備相應的標記抗體,需要額外的時(shí)間和成本。
  • 靈敏度較低:由于標記抗體的密度較低,直接ELISA的靈敏度可能低于間接ELISA。


  在直接ELISA法中,為了提高直接ELISA法的靈敏度,可以嘗試以下幾種方法:

  1.使用高親和力的標記抗體:

  選擇與抗原結合能力更強的標記抗體,可以提高抗原的識別效率,從而提高靈敏度。

  可以使用單克隆抗體,因為單克隆抗體具有更高的特異性和親和力。

  2.優(yōu)化標記方法:

  可以嘗試不同的標記方法,例如使用更有效的酶或熒光標記物,以提高標記效率和靈敏度。

  可以嘗試對抗體進(jìn)行優(yōu)化,例如改變抗體的結構或進(jìn)行修飾,以提高其標記效率。

  3.提高抗原的包被密度:

  在進(jìn)行ELISA實(shí)驗時(shí),可以通過(guò)增加抗原的包被濃度或延長(cháng)包被時(shí)間,提高抗原在反應板上的吸附密度,從而提高檢測靈敏度。

  4.使用信號放大技術(shù):

  可以使用一些信號放大技術(shù),例如生物素-鏈霉親和素系統,來(lái)放大信號,提高檢測靈敏度。

  5.使用更靈敏的檢測方法:

  可以使用更靈敏的檢測方法,例如化學(xué)發(fā)光檢測法,來(lái)提高檢測的靈敏度。

  6.優(yōu)化實(shí)驗條件:

  優(yōu)化實(shí)驗條件,例如調整孵育時(shí)間、洗滌步驟、底物濃度等,可以提高實(shí)驗的效率和靈敏度。

  7.使用更敏感的試劑盒:

  選擇專(zhuān)門(mén)為提高靈敏度設計的直接ELISA試劑盒,例如使用高靈敏度的酶標記抗體或高靈敏度的底物。

  間接ELISA


  間接ELISA使用兩種抗體:第一抗體(一抗)特異性識別待測抗原,第二抗體(二抗)特異性識別一抗。首先,待測抗原被吸附到反應板的孔中,并進(jìn)行洗滌去除未結合的抗原。然后,加入一抗,一抗與抗原結合。接著(zhù),加入酶標記的二抗,二抗與一抗結合。最后,加入底物溶液,酶催化底物發(fā)生顏色變化,顏色變化的程度與樣本中抗原的含量成正比。

  

  優(yōu)缺點(diǎn)分析:

  1.優(yōu)點(diǎn):
  • 降低成本:可以利用同一物種的多種一抗,并使用相同的標記二抗進(jìn)行檢測,降低實(shí)驗成本和工作量。
  • 提高靈敏度:由于一抗未被標記,可以保持其天然的免疫活性,提高檢測的靈敏度。此外,高密度的二抗標記能夠放大信號,進(jìn)一步提高檢測靈敏度。
  2.缺點(diǎn):
  • 存在交叉反應:二抗可能與其他抗體發(fā)生交叉反應,導致非特異性信號,降低檢測結果的準確性。
  • 延長(cháng)實(shí)驗時(shí)間:間接ELISA需要額外的孵育步驟,增加了實(shí)驗時(shí)間。

  在間接ELISA法中,為了避免存在交叉反應,要注意:

  1、選擇高純度的二抗:高純度的二抗可以降低雜質(zhì)抗體存在的可能性。

  2、選擇對一抗具有高度特異性的二抗:這樣可以確保二抗只與一抗結合,而不會(huì )與其他抗體結合。

  3、進(jìn)行對照實(shí)驗:在進(jìn)行ELISA實(shí)驗時(shí),需要設置對照組,排除二抗的交叉反應造成的假陽(yáng)性結果。

  夾心ELISA


  夾心ELISA需要使用兩對抗體,分別識別抗原的不同表位,而且這兩個(gè)表位不能重疊。首先,將捕獲抗體固定在反應板的孔中。然后,加入待測樣本,如果樣本中含有待測抗原,抗原就會(huì )與捕獲抗體結合。接著(zhù),加入酶標記的檢測抗體,它能夠識別與捕獲抗體結合的抗原。最后,加入底物溶液,酶催化底物發(fā)生顏色變化,顏色變化的程度與樣本中抗原的含量成正比。

  

  優(yōu)缺點(diǎn)分析:

  1.優(yōu)點(diǎn):
  • 高特異性:由于使用兩種針對同一抗原不同表位的抗體,夾心ELISA具有很高的特異性,可以有效地識別并檢測目標抗原。
  • 適用范圍廣:夾心ELISA適用于復雜或粗/不純的樣品,無(wú)需對抗原進(jìn)行預處理,可以直接進(jìn)行檢測。
  • 靈敏度高:夾心ELISA的靈敏度較高,可以檢測微量的抗原。

  2.缺點(diǎn):
  • 需要定制開(kāi)發(fā)抗體:如果市面上沒(méi)有現成的配對抗體,就需要定制開(kāi)發(fā),這會(huì )增加時(shí)間和成本。

競爭ELISA


  競爭性ELISA是一種用于測量樣本中抗原或抗體濃度的免疫學(xué)檢測方法,特別適用于檢測小分子抗原或抗體。它的原理是:將待測樣本中的抗原或抗體與已知濃度的標記抗原或抗體(參考物質(zhì))進(jìn)行競爭性結合,競爭結合到固相載體上的抗體或抗原。樣本中的抗原或抗體濃度越高,與標記參考物質(zhì)競爭結合的量就越少,最終產(chǎn)生的信號強度就越弱。

  優(yōu)缺點(diǎn)分析:

  競爭性ELISA可以基于直接ELISA、間接ELISA或夾心ELISA的檢測方法,因此其優(yōu)缺點(diǎn)也與所選用的檢測方法有關(guān)。

  1.優(yōu)點(diǎn):
  • 高靈敏度:可以檢測微量的抗原或抗體。
  • 適用于小分子抗原或抗體:可以檢測無(wú)法直接捕獲或檢測的小分子抗原或抗體。

  2.缺點(diǎn):

  • 操作復雜:需要額外的步驟來(lái)進(jìn)行競爭性結合反應。
  • 需要嚴格的質(zhì)量控制:需要確保參考物質(zhì)的濃度和質(zhì)量穩定。

  ELISA優(yōu)缺點(diǎn)


  酶聯(lián)免疫吸附試驗由EvaEngvall和PeterPerlmann于1971年首次描述,是一種廣泛使用的分析生物化學(xué)實(shí)驗。與其他免疫測定程序相比,ELISA具有許多優(yōu)點(diǎn):

  1、由于其出色的敏感性和特異性而被經(jīng)常使用。

  2、與放射免疫分析(RIA)測試等其他程序相比,ELISA的準確性更高。

  3、最常見(jiàn)的ELISA檢測形式是96孔微孔板。大多數ELISA微孔板都有分開(kāi)的孔,必要時(shí)可以進(jìn)行小規模的檢測。主要優(yōu)點(diǎn)是一次檢測可以進(jìn)行96次測定,結果通常在3小時(shí)內即可得出。這是一種省時(shí)且經(jīng)濟的方法。

  4、ELISA不需要使用放射性同位素或昂貴的輻射計數器。只需要精確的微量移液器、培養箱、清洗系統和微孔板分光光度計讀數器。

  ELISA缺點(diǎn)

  ELISA中對免疫原性抗原的抑制不足會(huì )導致錯誤結果。

  由于抗體是蛋白質(zhì),因此必須冷藏運輸和儲存。

  ELISA制備抗體需要大量時(shí)間且成本高昂。

  其中出現假陽(yáng)性和假陰性的概率很高。

  ELISA抗體存在不穩定性。

  ELISA實(shí)驗步驟


  一、實(shí)驗準備

  1.試劑準備:

  IL-1βELISA試劑盒(包含:包被抗體、檢測抗體、酶結合物、標準品、底物溶液、終止液、洗滌液等)

  PBS緩沖液(pH7.4)

  蒸餾水

  微量移液器

  吸頭

  酶標板

  酶標儀

  孵育箱

  洗板機(可選)

  離心機(可選)

  2.樣本準備:

  采集需要檢測IL-1β的樣本,例如血清、血漿、細胞培養上清液等。

  按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求處理樣本,例如離心去除細胞碎片、稀釋等。

  準備好空白對照、標準品和樣本。

  3.實(shí)驗器材準備:

  準備合適的酶標板,通常為96孔板。

  準備移液器、吸頭、孵育箱、洗板機、酶標儀等實(shí)驗器材。

  二、實(shí)驗步驟

  1.包被:

  將試劑盒中的包被抗體(捕捉抗體)稀釋至合適的濃度,并按照說(shuō)明書(shū)的要求加入到酶標板孔中。

  將酶標板置于4℃冰箱過(guò)夜或37℃孵育2小時(shí),使抗體牢固地吸附在酶標板上。

  用洗滌液洗滌酶標板3次,去除未結合的抗體。

  2.封閉:

  將試劑盒中的封閉液加入到酶標板孔中,并按照說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行孵育(通常為37℃1小時(shí))。

  封閉液可以阻止酶標板表面非特異性結合,減少實(shí)驗誤差。

  用洗滌液洗滌酶標板3次,去除未結合的封閉液。

  3.加樣:

  加入標準品、樣本和空白對照(空白對照通常只加入緩沖液,不加樣本)到酶標板孔中,每個(gè)孔的體積通常為100μL。

  按照說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行孵育(通常為37℃1小時(shí))。

  4.洗滌:

  用洗滌液洗滌酶標板3次,去除未結合的物質(zhì)。

  5.加入酶結合物:

  將試劑盒中的酶結合物(通常為酶標記的檢測抗體)稀釋至合適的濃度,并加入到酶標板孔中。

  按照說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行孵育(通常為37℃1小時(shí))。

  6.洗滌:

  用洗滌液洗滌酶標板3次,去除未結合的酶結合物。

  7.加入底物溶液:

  將試劑盒中的底物溶液加入到酶標板孔中,并按照說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行反應(通常為室溫避光孵育15-30分鐘)。

  酶催化底物發(fā)生顯色反應,產(chǎn)生顏色變化。

  8.終止反應:

  加入終止液(通常為酸性溶液),終止顯色反應,防止顏色繼續加深。

  9.比色:

  用酶標儀測量各孔的吸光度值,并按照試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標準曲線(xiàn)的制作,最終計算出樣本中IL-1β的濃度。

  10.’注意事項:

  嚴格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,不同的試劑盒可能會(huì )有不同的操作步驟和參數。

  確保所有試劑和器材處于最佳狀態(tài),例如試劑的有效期、酶標儀的校準等。

  注意實(shí)驗環(huán)境,例如溫度、濕度、光照等因素會(huì )影響實(shí)驗結果。

  做好實(shí)驗記錄,包括實(shí)驗日期、試劑批號、樣本信息、操作步驟、結果等,便于日后分析和追溯。

  注意實(shí)驗室安全,例如戴手套、穿實(shí)驗服、操作規范等。

  上述為大家介紹ELISA實(shí)驗原理及步驟,通過(guò)原理和步驟對ELISA有初步的認識。除此之外,在實(shí)驗中多加實(shí)踐,有助于提高實(shí)驗效果。上海通蔚實(shí)業(yè)有限公司擁有15年以上的ELISA試劑盒生產(chǎn)經(jīng)驗,搭建了ELISA試劑盒開(kāi)發(fā)和成熟抗原-抗體系統的良好平臺??商峁?000多種ELISA試劑盒,主要采用夾心法和競爭法,覆蓋3000個(gè)靶標,涉及小鼠、大鼠、牛、兔、豬等20多個(gè)種類(lèi)。如需試劑盒,歡迎前來(lái)咨詢(xún)!